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牛结核病污染场4种检测方法评估

时间:2020-06-09牛羊肉产业网

       为寻找最适合牛结核病污染场的检测方法,加快牛结核病净化,采用牛结核菌素(PPD)皮内变态反应试验(TST)、比较皮内变态反应试验(SICTT)、牛结核病 ELISA-γ- 干扰素试验(IFN-γ-ELISA)、牛结核病抗体 ELISA 试验 4 种方法,对某结核病污染牛场 300 头奶牛进行检测,并以 TST 为参考标准,对不同检测方法的检测结果进行对比分析。结果显示,这 4 种方法中,IFN-γ-ELISA 的阳性检出率最高,与 TST 相比,差异显著(P<0.05),而其他方法的阳性检出率均低于 TST。结果表明,IFN-γ-ELISA 方法的检测敏感性较高,在牛结核病污染场净化初期使用,可以尽量避免阳性牛漏检,从而加快牛结核病净化进程。


       牛结核病(bovine tuberculosis,bTB)是由分枝杆菌属牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M. bovis)引起的一种人兽共患慢性消耗性传染性疾病,给我国养牛业带来严重危害。世界动物卫生组织(OIE)将其列为须通报动物疫病,我国将其列为二类动物疫病。牛分枝杆菌感染宿主广泛,除可感染人外,还可感染 50 多种哺乳动物。牛结核病目前尚无有效疫苗预防,药物治疗成本太高,所以“检测 + 扑杀”是控制该疫病的主要手段。


       我国目前的牛结核病检测方法主要包括,结核菌素(PPD)皮内变态反应试验(TST)、比较皮内变态反应试验(SICTT)、γ- 干扰素 ELISA试验(IFN-γ-ELISA)、抗体 ELISA 试验和胶体金检测等。TST 是我国牛结核病检测的国家标准,也是国际贸易指定方法。此方法灵敏度高,但特异性差,无法排除其他结核杆菌干扰。SICTT 与 TST相比,可排除其他杆菌干扰,减少假阳性。TST 和SICTT 检测成本低,但操作麻烦、耗时长,结果判定主观性强。IFN-γ-ELISA 试验操作简单,但成本较高。抗体ELISA是现代抗体检测的主要方法,但牛分枝杆菌抗原表位复杂,不同阶段可产生不同抗体,因而导致检测阳性率偏低。


       结核病污染场内,牛分枝杆菌普遍存在,需要敏感性更高的检测方法,来尽量避免漏检,从而加快净化进程。本试验采用 TST、SICTT、IFN-γELISA 和抗体 ELISA 4 种检测方法,同时对牛结核病污染场的牛群进行检测,比较分析不同试验的检测结果,以期为我国牛结核病污染场的净化提供有效的检测方法。


       1 材料与方法


       1.1 材料


       1.1.1 试剂与仪器 牛 PPD、禽 PPD、INF-γ 夹心 ELISA 检测试剂盒(批次 P201906-001),均购自青岛瑞尔公司;牛分枝杆菌 ELISA 抗体检测试剂盒(批号 190504),购自韩国安世佳合有限责任公司。仪器包括:剪毛剪、0.5 mL 注射器、游标卡尺、酶标仪(包含 450 nm 和 620~650 nm 滤光片)、CO2 培养箱、12 孔细胞培养板、肝素钠采血管、移液器及吸头等。


       1.1.2 试验动物 某规模养殖场的300头泌乳牛。


       1.2 方法


      1.2.1 检测方法


       1.2.1.1 TST 试验 按照国家标准《动物结核病诊断技术》(GB/T 18645—2002)的要求操作和结果判定:采用牛型 PPD,剂量为 2 000 IU,分别于注射前和注射后 72 h 测量皮肤厚度,并计算皮厚差。皮厚差≥ 4.0 mm,为阳性;2.0 mm ≤皮厚差< 4.0 mm,为疑似;皮厚差< 2.0 mm,为阴性。疑似牛于第1 次检疫 60 d 后进行复检,仍为疑似时,60 d 后再复检,如仍为疑似,则判为阳性。


       1.2.1.2 SICTT 试验 采用牛 PPD 和禽 PPD,在牛颈部左侧分点皮内注射,注射点间隔 12~15 cm,72 h 后,观察注射部位的炎性反应,并量取皮皱厚,根据皮皱厚增加值判定。牛型 PPD 皮厚差减去禽型 PPD 皮厚差> 4 mm,判为阳性;1 mm <牛型PPD 皮厚差减去禽型 PPD 皮厚差≤ 4 mm,判为可疑;牛型 PPD 皮厚差≤禽型 PPD 皮厚差,判为阴性。


       1.2.1.3 IFN-γ-ELISA 试验 采集 5 mL 血液肝素抗凝血液,各取 1.5 mL 加入 3 个孔中,然后分别取 100 μL 的牛型 PPD、禽型 PPD 和阴性对照磷酸盐缓冲液(PBS),加入抗凝全血中,混匀后放于含 5% CO2 的培养箱中 37 ℃培养 18 h。用移液器小心吸取培养上清,转入 1.5 mL 离心管中,即获得刺激产生的 γ- 干扰素上清。取出单抗包被板,每孔加入 50 μL 样品稀释液,然后加入 50 μL 待测样品或对照,混匀后室温作用 1 h;洗涤,每孔加入 100 μL 酶标抗体,室温作用 1 h;洗涤后每孔加入 100 μL 底物,室温避光作用 30 min 后,加入终止液,测定 OD450 nm 值。当牛型 PPD 刺激上清的OD 值 -PBS 刺激上清的 OD 值 ≥ 0.1,且牛型PPD 刺激上清 OD 值 - 禽型 PPD 刺激上清 OD值≥ 0.1,为阳性,反之为阴性。


       1.2.1.4  抗体 ELISA 试验  按照牛分枝杆菌ELISA 抗体检测试剂盒操作步骤进行,计算 S/P值。S/P=(样品 OD450 nm 平均值 - 阴性对照 OD450 nm平均值)/(阳性对照 OD450 nm 平均值 - 阴性对照OD450 nm 平 均 值)。S/P ≥ 0.3 为 阳 性,S/P < 0.3为阴性。


       1.2.2 评估方法 以 TST 试验为参考标准,分别与 SICTT、IFN-γ-ELISA、抗体 ELISA 检测结果比较,计算符合率,并运用 SPSS 软件进行对比,分析敏感性差异。


       2 结果与分析


       2.1 TST 与 IFN-γ-ELISA


       对比结果(表 1)显示:TST 检出阳性 114 份,IFN-γ-ELISA 检出阳性 154 份,符合率为 72.7%,经 SPSS 分析,P < 0.05,说明 IFN-γ-ELISA 阳性检出率显著高于 TST,表明其敏感性明显高于 TST。


表 1 TST 与 IFN-γ-ELISA 检测结果对比  单位:份

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       2.2 TST 与 SICTT


       对比结果(表 2)显示:TST 检出阳性 114份,SICTT 检出阳性 103 份,符合率为 96.3%,经SPSS 分析,P > 0.05,说明 SICTT 阳性检出率略低于 TST,但差异不显著,表明两种方法的敏感性相似。


表2 TST 与 SICTT 检测结果对比  单位:份

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       2.3 TST 与抗体 ELISA


       对比结果(表 3)显示:TST 检出阳性 114 份,抗体 ELISA 检出阳性 21 份,符合率为 69.0%,经SPSS 分析,P < 0.05,说明抗体 ELISA 阳性检出率显著低于 TST,表明其敏感性明显低于 TST。


表 3 TST 与抗体 ELISA 检测结果对比  单位:份

3.png


       3 讨论


       近年来,我国牛结核病流行率普遍升高,结核病污染场数量逐渐增加。本试验利用 4 种检测方法,对结核病污染场的奶牛进行检测。以 TST为参考标准,分别与其他 3 种方法进行比较,结果发现 IFN-γ-ELISA 敏感性最高,明显大于 TST,而其他 2 种方法的敏感性都低于 TST。在牛结核病污染场的净化过程中,要将所有感染牛尽可能全部筛检出来,这就需要敏感性高的检测方法,因此IFN-γ-ELISA 是首选的检测方法。


       TST 试验是国家标准,也是国际贸易指定方法,但其结果判定存在人为误差,尤其是大量检测时,会出现阳性漏检。在牛结核病污染场的净化初期,需要进行大量检测,如果采用 TST 检测,就会漏检感染牛,使其继续污染牛群。SICTT 虽然可排除禽结核杆菌的干扰,检测结果准确,但其阳性检出率更低,同样不适合牛结核病污染场初期的净化。抗体 ELISA 检测是现代血清检测的主要方法,操作简单、耗时少,但因不同感染阶段的牛分支杆菌抗体比较复杂,无法准确捕获,导致阳性检出率也明显比 TST 偏低,因此也不适合用于牛结核病污染场初期的净化检测。


       TST 和 SICTT 这两种方法适合在基层推广,成本低,但主观性强,检测过程对牛的应激影响较大。抗体 ELISA 检测时间短,出结果快,但成本较高,阳性检出率偏低。IFN-γ-ELISA 操作复杂、成本高,检测要求较高,不适合在基层推广,但检测敏感性高。因此,在实际的牛结核病检测中,应根据不同的需要和条件,选择合适的检测方法,也可以不同方法联合使用。在条件不允许情况下,可以用 TST 对牛结核病污染场进行检测。


       因 IFN-γ-ELISA 是 4 个方法中最敏感的方法,所以在条件允许的情况下,在牛结核病污染场最适合选用,这样可以尽量避免漏检感染牛。在牛结核病污染场,患结核病的牛数量较多,如果检测方法不敏感,就会导致大量阳性牛漏检,使牛群净化困难。如果每年春秋两季,对牛场进行 IFN-γELISA 检测,及时隔离淘汰阳性牛,连续检测几年,牛场就会达到净化目标。


4 结论


评估认为,在 TST、SICTT、IFN-γ-ELISA 和抗体 ELISA 4 种检测方法中,IFN-γ-ELISA 方法敏感性最高,阳性检出率最高,可以尽可能地将感染牛全部检出,减少漏检,因此最适合用于牛结核病污染场初期的净化。





本文摘自阳光畜牧网


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